Los hongos son microorganismos productores de esporas, generalmente microscópicos, eucarióticos, ramificados y a menudo filamentoso, carecen de clorofila y tienen paredes celulares que contienen quitina, celulosa, o ambos componentes. La mayoría de las 100 000 especies de hongos conocidas son estrictamente saprófitas y viven sobre materia orgánica en descomposición. Alrededor de 50 especies de hongos producen enfermedades en el hombre y casi el mismo número ocasiona enfermedades en los animales, la mayoría de las cuales son enfermedades superficiales de la piel o de sus apéndices. Se considera que más de 8 000 especies de hongos producen enfermedades en las plantas (Agrios, 2005).

Todas las plantas son atacadas por algún tipo de hongo que perjudican a uno o más tipos de plantas. Algunos hongos crecen y se reproducen sólo cuando establecen una cierta asociación con las plantas que les sirven de hospedante durante todo su ciclo de vida, estos hongos se conocen como parásitos obligados o biótrofos. Otros requieren de una planta hospedante durante cierta etapa de su ciclo de vida, y pueden concluir desarrollándose en materia orgánica descompuesta o bien pueden crecer y reproducirse tanto en materia orgánica como en plantas vivas, siendo éstos conocidos como parásitos no obligados (Urbina, 2019).

Los efectos que producen los hongos en las plantas pueden ser de tipo local, cuando afectan una porción pequeña del tejido, o general si causan daño completo a toda la planta, lo que depende del tipo de planta que parasiten; sin embargo, en una misma planta pueden producir primero un efecto local y luego uno generalizado. El daño producido por los hongos es principalmente la muerte del tejido —necrosis— que infectan. También pueden producir atrofia completa de la planta o de algunas de sus partes y en otros casos pueden causar crecimiento excesivo —hipertrofia—. Además, los hongos que afectan la raíz, o bien el sistema vascular de la planta, tienden a producir clorosis en la planta y marchitez (García, 2004).

Según el International Seed Testing Association (ISTA, 2003), los daños más comunes provocados por hongos en las semillas son: aborto, reducción del tamaño, podredumbres, esclerotización, necrosis, decoloración, reducción de la viabilidad y pérdida de germinación. Una amplia gama de hongos han sido caracterizados como causantes del deterioro patológico de una variedad de productos agrícolas, siendo los más comunes especies de Alternaria, Botrytis, Diplodia, Monilinia, Penicillium, Colletotrichum, Phomopsis, Fusarium, Rhizopus y Mucor [Fundación Hondureña de Investigación Agrícola (FHIA, 2007)]; muchos de ellos, son capaces de producir micotoxinas, son contaminantes de granos y semillas, con incidencia a nivel de campo y/o almacenamiento (Castaño-Zapata, 1994).

En la actualidad, se está comercializando semilla local de moringa, sin conocer el estado fitosanitario de la misma. Esta comercialización obedece a la expansión de las plantaciones de esta especie forrajera, por su atributo de alto valor proteico, en la alimentación animal, muy conveniente para los hatos ganaderos. Poca es la información bibliográfica sobre los patógenos asociados a las semillas de moringa, particularmente en las localidades donde es sembrada en el estado Monagas. En el Himalaya, Mahesha et al. (2019) reportaron en semillas de moringa, la presencia de 16 especies de hongos: Acremonium sp., Alternaria alternata, Alternaria solani, Alternaria tenuissima, Aspergillus flavus, Cercosporidium sp., Cladosporium cladosporioides, Cordanapauc iseptata, Fusarium roseum, Ochroconis sp., Physarum sp., Spegazzinia sp., Stachybotrys chartarum, Tetraploa aristate, Trichoderma harzianum y Verticillium sp.; en América, específicamente en Cuba, Martínez-De la Parte et al. (2013) detectaron 46 especies de 26 géneros fúngicos asociados a lotes importados de semillas de moringa, entre los que destacan Fusarium, Aspergillus y Chaetomium; de modo análogo, en México, Gómez-Martínez et al. (2020), identificaron al género Fusarium en muestras de semillas y testas de semillas, de dos variedades de moringa.

Varias son las experiencias de aislamiento e identificación de hongos fitopatógenos en semillas, realizadas en especies vegetales de importancia agrícola. En gramíneas, como el arroz (Oryza sativa) ( Neninger et al., 2003) o especies de pastos —Brachiaria, Panicum y Chloris— (Pazos et al., 2011), los géneros de hongos fitopatógenos con mayor frecuencia de detección en semillas fueron: Drechslera, Colletotrichum, Fusarium y Curvularia; mientras que, en semillas de leguminosas, los hongos fitopatógenos de mayor frecuencia fueron: Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Alternaria alternata, Fusarium moniliforme, Rhizopus nigricans y Trichoderma viridae, presentes en todas las muestras evaluadas ( Ghangaokar y Kshirsagar, 2013). Por lo antes expuesto y en consideración a la calidad fitosanitaria de las semillas actualmente empleadas en la instalación de lotes de moringa, el objetivo de esta investigación fue de identificar hongos asociados a semillas de moringa procedentes de los municipios Cedeño y Maturín del estado Monagas, Venezuela.

MATERIALES Y MÉTODOS

Área del experimento

El ensayo experimental se condujo en las instalaciones de la Clínica Universitaria de Diagnóstico Agrícola —CUDA— perteneciente al Departamento de Ingeniería Agronómica de la Escuela de Ciencias del Agro y del Ambiente. La Clínica, está ubicada en el Campus Juanico de la Universidad de Oriente, Núcleo Monagas, Venezuela, entre las coordenadas de 9º45’ LN y 63º11’ de LW, con altura de 65 metros sobre el nivel del mar (Climate-Data.org, 2020). De los 13 municipios del estado Monagas, solo se colectaron muestras de semillas en Cedeño y Maturín, por ser los municipios pioneros en el cultivo de moringa a escala comercial, debido a las condiciones edafoclimáticas favorables y la vocación agrícola-ganadera.

Identificación de hongos asociados a semillas de moringa

El material para la detección de hongos se obtuvo de cuatro localidades del estado Monagas —denominadas procedencias—. Las semillas fueron previamente caracterizadas en aspectos físicos e intrínsecos, descritos en el Cuadro 1.

Se recolectaron muestras de 200 g de semilla por procedencia, las cuales fueron almacenadas en condiciones de laboratorio en envases plásticos con sus respectivas tapas, limpios y secos, previamente identificados.

De cada procedencia, se seleccionaron aleatoriamente 250 semillas, de las cuales, 125 fueron sembradas directamente en cámaras húmedas —semilla sin desinfección (SSD)— constituidas por capsulas de Petri acondicionadas con dos hojas de papel absorbente [Toallas Multiusos Absorbo, Papeles Venezolanos C.A. (PAVECA)] estéril, humedecido con agua destilada estéril. Las otras 125 semillas fueron tratadas —semilla desinfectada (SD)— en solución al 10 % v/v de hipoclorito de sodio 3.5 % —Nevex®— durante dos minutos y posteriormente enjuagadas por tres veces en agua destilada estéril, en lapsos de minuto y medio. Al finalizar el periodo de retirado de los residuos del hipoclorito, las semillas fueron colocadas para secar sobre papel absorbente estéril y seguidamente sembradas en cámaras húmedas constituidas por capsulas de Petri acondicionadas con papel absorbente —Blotter test— (ISTA, 2003). Las capsulas de Petri fueron mantenidas en condiciones de laboratorio a 27 °C ± 2 °C, durante 15 días, con luminosidad natural de 12 h día^-1 aproximadamente.

El experimento se condujo en diseño de bloques al azar con arreglo factorial 4 x 2 siendo el factor A: Procedencia de la semilla (1, 2, 3 y 4) y factor B: condición de siembra (SSD y SD), con cinco réplicas por combinación, cada réplica representada por cinco cápsulas de Petri, conteniendo cada una cinco semillas de moringa sembradas de forma equidistante.

Las evaluaciones se realizaron a los 5, 10 y 15 días luego de la incubación; se realizaron observaciones con el microscopio estereoscópico de las colonias de hongos presentes por cápsula, las cuales se clasificaron por color y aspecto homogéneo del micelio mediante la metodología descrita por Ortega-Amaro et al. (2017). Se cuantificó la frecuencia de aparición de cada tipo de colonia fúngica.

En las capsulas de Petri, las semillas tuvieron numeración permanente, con el objetivo de mantener siempre el mismo orden de lectura y registro de las colonia fúngicas.

De cada colonia fúngica, se realizó aislamientos en medio PDA —papa-dextrosa-agar— marca Hopebio®, —preparado a razón de 42 g L^-1 y tratado con tres gotas de ácido láctico por placa— hasta obtener cultivos purificados; posteriormente se realizaron montajes independientes con cinta adhesiva y tinción de azul de metileno (Ortega-Amaro et al., 2017) para observar en microscopio óptico e identificar por géneros según la clave taxonómica de Barnett y Hunter (1998). Adicionalmente, se determinó el porcentaje de germinación, mediante enumeración de las semillas germinadas por placa; se consideraron semillas germinadas aquellas con emisión de radícula de longitud mayor o igual a 5 mm (Luna, 2019).

Las frecuencias relativas (%) obtenidas en germinación, micoinfestación y aparición o ausencia de cada género de hongo, por procedencia y condición de siembra fueron analizadas mediante prueba de asociación Chi Cuadrado (X²). La comparación directa entre condiciones de siembra —SSD y SD— fue realizada por la prueba de Mann Whitney, mientras que la comparación directa entre procedencias fue analizada por la prueba Kruskal Wallis.

El comportamiento de la germinación (%) respecto a cada género fúngico fue analizado de manera independiente por procedencia, mediante análisis de correlación de Spearman. Todos los procedimientos estadísticos, descriptivos e inferenciales, fueron realizados en el programa estadístico INFOSTAT versión 2018 (Di Rienzo et al., 2018).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Géneros fúngicos identificados

De manera general, se detectaron seis géneros de hongos asociados a las semillas de moringa. Se identificaron los géneros: Fusarium sp., Monilia sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., Rhizopus sp. y Trichoderma sp. Es de resaltar que en el medio de cultivo, para los aislamientos del género Fusarium, se presentaron dos variantes: una de color morado y otra de color rojo; mientras que para el género Aspergillus, se presentaron cuatro tipos de coloración de micelio: verde-amarillo, marrón claro, marrón oscuro y negro.

De acuerdo con el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA, 2022), estos seis géneros fúngicos pueden ser clasificados en tres grupos funcionales: hongos de campo —Fusarium y Trichoderma—, hongos de almacenamiento —Aspergillus y Penicillium— y hongos contaminantes genéricos —Monilia y Rhizopus—, cada uno con origen, hábitat y habito particular.

Fusarium. Es considerado uno de los géneros fúngicos de mayor distribución mundial, con alto potencial patogénico y de diseminación (Nash-Smith, 2007); puede ser localizado en el suelo y/o en tejidos vegetales (Tapia y Amaro, 2014) y habitualmente en semillas (Uribe-Cortés et al., 2020). Algunas especies de este género están asociadas a síntomas de enfermedades en moringa: Fusarium solani está asociada con la presencia de manchas y clorosis de hojas; de modo similar, con manchas y necrosis de tallos, marchitez y muerte de plántulas. De manera análoga, Fusarium semitectum está vinculado con la pudrición del fruto (Lezcano et al., 2014; Vaillant et al., 2015).

Trichoderma. Este género de hongos presenta crecimiento acelerado, alta adaptabilidad a condiciones ecológicas y hábito saprófito ( Zeilinger et al., 2016), de preferencia a espacios con abundante materia orgánica ( Sandle, 2014). Por su función micoparásita, se emplea para combatir hongos fitopatógenos, con la finalidad de disminuir la infestación natural y brindar protección a las semillas posterior a la siembra (Martínez et al., 2013).

Aspergillus y Penicillium. Son géneros típicos en condiciones de almacenamiento (Mediavilla-Molina et al., 1992), con habilidad para invadir semillas y granos de bajo contenido de humedad, crecer en amplio rango de temperaturas y con pocas excepciones, infectar antes de la cosecha (PROAIN, 2021). Colonizan activamente las semillas, donde causan deterioro y reducción en la germinación, a través de principios enzimáticos y toxinas ( Howlett, 2006). El género Aspergillus recientemente se vincula a la moringa, como un hongo endófito, localizado a nivel de tallo (Mosquera-Rivera et al., 2020).

Monilia. Representa el estado conidial (asexual) del género Monilinia spp. ( Tuset et al., 2022), habita mayormente regiones húmedas y ataca principalmente a frutales, siendo agente causal de la podredumbre marrón ( Malvárez et al., 2001). Se comporta como un patógeno de heridas, puesto que infecta frutos a partir de lesiones provocadas por insectos y/o roces mecánicos ( Zuñiga et al., 2011).

Rhizopus. Género cosmopolita, en su mayoría saprobios —descomponedores—, se alimentan de materia orgánica, siendo pocos, parásitos o patógenos ( Lennartsson et al., 2014); las especies fitopatógenas causan pudrición postcosecha (Velásquez-del Valle et al., 2008), mientras otras —Rhizopus oryzae— son útiles en la industria de alimentos, por producir abundante ácido láctico (Londoño-Hernández et al., 2017).

Dinámica fúngica de acuerdo con la condición de siembra

En la Figura 1, se presentan los valores de frecuencia fúngica y número de colonias.semilla-1 obtenidos en las condiciones de siembra —semilla desinfectada y sin desinfectar—. El análisis estadístico por la prueba de Mann Whitney detectó diferencias significativas a 1 % de probabilidad, en relación con la presencia y diversidad fúngica cuantificada entre ambas condiciones, con superioridad estadística para las semillas de moringa no desinfectadas, respecto a las semillas desinfectadas.

Figura 1.
Frecuencia fúngica (%) y número de colonias.semilla-1 en semillas de moringa, sin desinfectar (SSD) y desinfectadas (SD).

SSD: Semillas sin desinfectar; SD: Semillas desinfectadas. Valores promedios seguidos de letras distintas representan diferencias significativas por la prueba de Mann Whitney a 1 % de probabilidad.

La diferencia obtenida a favor de la semilla no desinfectada es debido a que en dicha condición se mantiene intacta la población fúngica ubicada en la parte externa de la semilla, lo que favorece de forma significativa, la presencia y crecimiento de los hongos presentes en el material; mientras que, al desinfectar, se elimina la población fúngica superficial y se limita el crecimiento, solo para los hongos presentes al interior (Márquez et al., 2007). Por ello, la desinfección de semillas, como práctica cultural, es ampliamente recomendada a modo de reducir riesgos de diseminación, además de proteger la semilla durante su conservación (Vélez y Castrillón, 2018).

Aislamientos fúngicos en semillas tratadas o no con hipoclorito de sodio

Las frecuencias relativas (%) de aparición de los géneros fúngicos identificados, en las dos condiciones de siembra y su evolución durante lecturas sucesivas a los 5, 10 y 15 días de evaluación, se muestran en la Figura 2. Dichos comportamientos permiten asociar a los géneros Fusarium y Rhizopus como hongos infestadores, es decir, localizados mayormente en el exterior de la semilla de moringa —infestada—, mientras que el género Penicillium se ubica más al interior de la semilla —infectada—; el género Aspergillus resultó ser el más versátil, al liderar las frecuencias de aparición en ambas condiciones de siembra, con lo cual puede estar presente en la semilla de moringa tanto externa como internamente.

En semillas de moringa sin desinfectar, destacan los géneros Fusarium, Aspergillus y Rhizopus, con porcentajes de aparición superiores a 40 %, mientras que en semillas desinfectadas, los mayores porcentajes corresponden a los géneros Aspergillus y Penicillium —29.6 % y 22.8 %, respectivamente—. El género Monilia mantuvo, en ambas condiciones de siembra, porcentajes de aparición menores a 10 %, mientras el género Trichoderma, solo fue detectado en semillas no desinfectadas, con frecuencias menores o iguales a 1.2 %.

Por ser Fusarium un hongo de campo, resulta muy factible ubicarlo en su mayoría al exterior de la semilla de moringa, debido a que, en semilla recién cosechada o semilla nueva, el poco tiempo de contacto dificulta al hongo penetrar significativamente el tejido seminal ( Warman y Aitken, 2018). En cambio, la mayor presencia de Penicillium al interior de la semilla de moringa puede asociarse a lotes de semilla almacenados por tiempo prolongado, donde este tipo de hongo, dispone condiciones ambientales favorables para poblar internamente la semilla (PROAIN, 2021).

Figura 2.
Frecuencia relativa (%) de aparición por género fúngico en semillas de moringa, sin desinfectar (SSD) y desinfectadas (SD).

SSD: Semillas sin desinfectar; SD: Semillas desinfectadas.

En cuanto al género Aspergillus, debido a su alta proliferación en semillas almacenadas y la existencia de razas que pueden atacar a nivel de campo (Sepúlveda y Piontelli, 2005), es perfectamente justificable la notable participación de este hongo en los lotes de semilla de moringa evaluados.

Los resultados en esta investigación se ratifican con los géneros fúngicos detectados por Martínez-De la Parte et al. (2013), de los cuales Aspergillus y Fusarium fueron los más representativos con 19.07 % y 15.68 %, respectivamente; y con lo reportado por Gómez-Martínez et al. (2020) quienes encontraron infestación con Fusarium en 70 % de las semillas de moringa muestreadas; sin embargo, también se evidenció la presencia de altas proporciones de Rhizopus en las semillas estudiadas de los municipios Maturín y Cedeño del estado Monagas.

Dinámica fúngica entre procedencias

Semillas no desinfectadas. En el Cuadro 2 se presenta el comportamiento de la germinación y la presencia de hongos en semillas de moringa sin desinfectar.

De manera general, se observa que, independiente del poder germinativo de la semilla muestreada en las localidades, se constata infestación por hongos por encima del 92 %; aunque, el número de colonias fúngicas.semilla^-1 fue mayor en la semilla sin poder germinativo —Terrenos del Guarapiche—, que también poseía mayor tiempo de almacenamiento —10 meses postcosecha— y de manera similar, presentó el mayor nivel de infestación fúngica por Aspergillus y Rhizopus.

En las semillas procedentes del municipio Cedeño, La Tomatera, el género Fusarium fue más frecuente —88 %—, mientras que, los géneros Penicillium y Trichoderma estuvieron asociados exclusivamente a semillas procedentes del sector Brisas del Aeropuerto. En orden decreciente, el porcentaje de germinación de las semillas fue de 61.60 % < 36.80 % < 1.60 % < 0 %, y correspondió a las muestras procedentes de la Tomatera, Las Avenidas, Brisas del Aeropuerto y Terrenos del Guarapiche, respectivamente.

Por el análisis de Chi Cuadrado se detectó asociación significativa, a 5 % y 1 % de probabilidad, entre las variables evaluadas en relación a la procedencia de la semilla de moringa; la excepción correspondió a las frecuencias del género Monilia, para la cual no hubo efecto significativo. Por otra parte, en la comparación estadística para el número de colonias.semilla^-1, también se detectó diferencias significativas entre procedencias. El número de colonias.semilla^-1 fue estadísticamente superior en semillas del sector Guarapiche (2.01), mientras que en semillas del municipio Cedeño fue más bajo (1.14). Las semillas procedentes de Las Avenidas y Brisas del Aeropuerto, presentaron diversidad fúngica intermedia, entre 1.58 y 1.59; respectivamente.

La edad post cosecha de la semilla, entre procedencias, determinó considerablemente el comportamiento en germinación y calidad fitosanitaria de las semillas (Ruíz-Pérez et al., 2017); la semilla de la Tomatera de Caicara fue el material cosechado más reciente, presentando los mejores registros de germinación y a su vez la menor carga fúngica. De manera similar, la semilla de la Tomatera, estuvo asociada con mayores infestaciones por Fusarium, mientras que la semilla proveniente del sector Guarapiche, habiendo sido almacenada por largo tiempo, perdió completamente su poder germinativo y presentó mayor carga fúngica, asociada a géneros como Aspergillus y Rhizopus.

Semillas desinfectadas. Los valores de germinación y presencia fúngica en semillas de moringa desinfectadas procedentes de cuatro localidades del estado Monagas, se muestran en el Cuadro 3. El análisis Chi Cuadrado detectó asociación significativa a 1 % de probabilidad entre las variables evaluadas con relación a la procedencia de la semilla, con excepción del género Trichoderma, el cual no fue reportado en esta condición de siembra. La comparación para el número de colonias.semilla^-1 también detectó diferencia significativa entre procedencias.

En este caso, en semillas de moringa desinfectadas, la procedencia Tomatera de Caicara, nuevamente estuvo vinculada con la mayor germinación (55.2 %) y mayor frecuencia del género Fusarium (14.40 %), mientras que las procedencias Las Avenidas y Terrenos de Guarapiche, se asociaron a mayor infectación fúngica (68.8 %). La semilla del sector Guarapiche se asoció a mayor frecuencia de los géneros Monilia, Aspergillus y Rhizopus (13.60 %; 61.40 % y 18.40 %, respectivamente), mientras que las semillas procedentes de Brisas del Aeropuerto estuvieron asociadas a mayor frecuencia del género Penicillium (38.40 %).

Respecto a la variable número de colonias fúngicas.semilla^-1 nuevamente se obtuvo superioridad para las semillas procedentes del sector Guarapiche (1.01), seguidas de las procedencias Las Avenidas y Brisas del Aeropuerto, correspondiendo a 0.79 y 0.63, respectivamente; mientras que las semillas de moringa obtenidas de la Tomatera Caicara, registró nuevamente, la menor carga fúngica (0.18).

Está demostrado que la procedencia influye comparativamente en las características de las semillas, debido a que, la condición agroecológica —suelo-clima-planta—, así como la tecnología aplicada en los procesos pre y postcosecha, raramente coincide entre localidades, lo que tributa fácilmente hacia diferentes situaciones fitosanitarias, sobre todo en cultivos no industrializados (Cavallo et al., 1994; Palmero et al., 2005).

Relación entre la germinación y géneros fúngicos asociados a las semillas.

En el análisis de correlación de Spearman por procedencia para las variables germinación y frecuencias (%) de los géneros fúngicos reportados, hubo cuatro correlaciones significativas, tres de ellas en la procedencia Tomatera Caicara y una en la procedencia Las Avenidas. De acuerdo con el análisis, en semillas de moringa sin desinfectar, el género Fusarium se correlacionó positivamente con la germinación (r_s = 0.37**), mientras que, el género Aspergillus, en ambas condiciones de siembra, con y sin desinfección, se correlacionó negativamente con la germinación (r_s = -0.35** y -0.23*, respectivamente).

La correlación positiva entre el género Fusarium y la germinación en semillas de moringa sin desinfectar, describe que este hongo al localizarse externamente, no afecta de manera directa la germinación; tal comportamiento estadístico infiere que a medida que se incrementa la frecuencia de este fitopatógeno fúngico indistintamente aumenta la germinación de la semilla infestada; sin embargo, toda la literatura revisada indica que, el género Fusarium, detectado en semillas, incide severamente sobre la germinación (Borges y Urdaneta, 2010; Álvarez-Orozco et al., 2021). El momento del análisis de las semillas de moringa, está asociado a su condición fitosanitaria y sus características físicas e intrínsecas.

Para el caso de la correlación negativa obtenida entre el género Aspergillus y la germinación de las semillas de moringa, con y sin desinfección, ratifica que este fitopatógeno afecta significativamente la germinación de la semilla ( Howlett, 2006); esto indica que, en la medida que se incrementa la frecuencia de Aspergillus en las semillas, disminuye el porcentaje de germinación.

CONCLUSIONES

Se detectaron los hongos Aspergillus sp., Rhizopus sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Monilia sp. y Trichoderma sp.

El aislamiento fúngico más frecuente detectado en las semillas fue Aspergillus sp. y en orden decreciente se ubican Rhizopus sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Monilia sp. y Trichoderma sp.

En semillas recién cosechadas se observó con más frecuencia la presencia de Fusarium, mientras que, para semillas con mayor tiempo de almacenamiento se observaron los géneros Aspergillus, Rhizopus y Penicillium.

En semillas sin ningún poder germinativo, los géneros Aspergillus y Rhizopus alcanzaron niveles de infestación del 100 %.

La detección de Trichoderma sp., solo ocurre cuando la semilla no se somete a tratamiento de desinfección y su porcentaje de detección es muy bajo.

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Notas de autor