Uso de evidencia genética en la
investigación del tráfico ilegal de reptiles en Colombia. Reporte de caso.
Use of genetic
evidence in the investigation of illegal reptile trafficking in Colombia. Case Report.
Yurbi Lailini Robles González 1*: https://orcid.org/0000-0002-7903-8153
Diego Alejandro Ussa Pérez 1: https://orcid.org/0000-0001-8989-452X
Carlos Miguel del Valle Useche 1: https://orcid.org/0000-0003-1973-0444
1Policía Nacional de Colombia; Dirección de Investigación Criminal e INTERPOL; Laboratorio de Identificación Genética Forense de Especies Silvestres; Bogotá, Colombia.
*Correspondencia a: yurby.robles@correo.policia.gov.co
PALABRAS CLAVE
Taxonomía molecular, ADN mitocondrial, Genética Forense, Tráfico, Animales silvestres.
KEYWORDS
Molecular Taxonomy, Mitochondrial DNA, Forensic Genetics, Trafficking, Wild animals.
CITAR COMO
Robles González Y, Ussa Pérez D, Del Valle Useche C. Uso de evidencia genética en la investigación del tráfico ilegal de reptiles en Colombia. Reporte de caso. Rev. cienc. forenses Honduras. 2022;8(2):29-35. doi:10.5377/rcfh.v8i2.15970
HISTORIA DEL ARTÍCULO
Recepción: 07-02- 2023
Aprobación: 10-02- 2023
DECLARACIÓN DE CONFLICTOS DE INTERÉS, RELACIONES Y ACTIVIDADES FINANCIERAS O COMERCIALES
Ninguna
RESUMEN
Justificación: En Colombia, el comercio de especies de fauna silvestre sin la documentación necesaria es prohibido por ley, por lo que, en el contexto de una investigación penal sobre venta de reptiles a través de internet, como parte de una diligencia de allanamiento y registro, se realizó el procesamiento del lugar de los hechos. Objetivo: realizar la asignación taxonómica más probable utilizando análisis genético en muestras biológicas recolectadas del lugar de los hechos para establecer la presencia de reptiles, dada la ausencia de animales en el momento del allanamiento. Métodos: se recolectaron seis muestras biológicas que incluyeron un trozo de muda de piel, hisopados de superficies y materia fecal, para su posterior procesamiento siguiendo los protocolos de análisis establecidos. Se realizó extracción de ADN empleando sílice y se amplificó un marcador mitocondrial 12S-120pb; los fragmentos resultantes fueron secuenciados y las secuencias fueron comparadas con la información disponible en la base de datos Genbank mediante el algoritmo BLASTn. Resultados y discusión: a partir de los datos obtenidos de la comparación realizada, 100% de cobertura y 100% de identidad y tras analizar las características de cada grupo taxonómico y la información genética disponible se realizó la asignación taxonómica. En la muestra de muda de piel se encontró dificultad para la amplificación y secuenciación de todo el fragmento, lo que limitó el empleo de marcadores de mayor tamaño, sin embargo, a partir de la información obtenida se logró la identificación de la especie Boa constrictor (boa común); en el caso de la materia fecal y los hisopados se determinó la presencia de muestras provenientes de grupos taxonómicos comúnmente empleados para alimentación de algunas especies de reptiles, como Mus musculus (ratón común) y el género Rattus (especies de ratas). Conclusión: El marcador mitocondrial 12S-120pb empleado en este caso resultó exitoso para la obtención de secuencias a partir de muestras forenses, sin embargo, la utilización de cualquier marcador para la asignación taxonómica depende en gran medida de la información disponible y las características propias de cada grupo taxonómico.
ABSTRACT
Introduction: In Colombia, the wildlife species trade without the necessary documentation is banned by law, so in the context of a criminal investigation into the sale of reptiles over the Internet, as part of a search procedure, the scene was processed. Objective: To make the most probable taxonomic assignment using genetic analysis in biological samples collected from the scene to establish the presence of reptiles, given the absence of animals at the time of the search. Methods: Six biological samples, including a skin shedding, surface swabbing and fecal samples were collected for their subsequent processing in the laboratory following the established analysis protocols. DNA extraction was performed using a silica-based DNA isolation method and a 12S-120bp mitochondrial marker was amplified; the resulting fragments were sequenced and the sequences were compared with the information available in the Genbank database using the BLASTn algorithm. Results and discussion: Based on the data obtained from the comparison, 100% coverage and 100% identity, and after analyzing the characteristics of each taxonomic group and the available genetic information, the taxonomic assignment was made. In the skin shedding sample, difficulties were found for the amplification and sequencing of the entire fragment, which limited the use of larger markers, however, from the information obtained, the species identification for Boa constrictor (common boa) was achieved; In the case of feces samples and swabbing, the presence of DNA from taxonomic groups commonly used for feeding some reptile species such as Mus musculus (common house mouse) and the genus Rattus (rat species) was determined. Conclusion: The 12S-120bp mitochondrial marker used in this case was successful for obtaining sequences from forensic samples; however, the use of any marker for taxonomic assignment depends largely on the information available and the characteristics of each taxonomic group.
INTRODUCCIÓN
Los crímenes contra la vida silvestre, se han convertido en un negocio global muy lucrativo y ampliamente distribuido, con un valor de comercio ilegal estimado entre 7 y 23 billones de dólares por año1, favoreciendo la pérdida de biodiversidad, el empeoramiento de la crisis climática y la diseminación de enfermedades zoonóticas. En lo que respecta al tráfico y la comercialización ilegal, el panorama es cada vez más complejo, considerando el aumento de la demanda, la captura múltiple y el uso de la misma especie en diferentes mercados 2. El empleo de metodologías basadas en el análisis de ADN, particularmente marcadores de ADN mitocondrial, abrió la posibilidad para la identificación de productos o subproductos de origen biológico en los diferentes contextos de crímenes contra la vida silvestre 3, sin embargo, debido a la gran cantidad de organismos, la limitada información en bases de datos y las distintas aplicaciones de esta metodología, su uso abarca diferentes tópicos que deben ser evaluados para cada marcador a emplear, cumpliendo a cabalidad con criterios de estandarización y validación que garanticen la admisibilidad de las pruebas en el contexto judicial 4.
En Colombia el comercio de especies de fauna silvestre es prohibido por ley 5, el caso que presentamos, corresponde a una investigación penal llevada a cabo por la Policía Nacional de Colombia en la Dirección de Protección y Servicios Especiales, sobre la venta de reptiles a través de internet; como parte de una diligencia de allanamiento y registro 6, para la cual se solicitó el apoyo de peritos del Laboratorio de Identificación Genética Forense de Especies Silvestres de la Dirección de Investigación Criminal e INTERPOL para la toma de muestras biológicas durante el procesamiento del lugar de los hechos, el posterior análisis genético y la respectiva asignación a categoría taxonómica. Se recolectaron seis muestras biológicas que incluyeron dos hisopados de la superficie de un terrario, tres muestras de materia fecal y un trozo de muda de piel, para su posterior procesamiento, con el propósito de asignarlas a una categoría taxonómica.
MÉTODOS
Toma de muestras
La toma de muestras se llevó a cabo durante el procesamiento del lugar de los hechos (Figura 1), por personal experto en la recolección de evidencia traza de origen biológico del Laboratorio de Identificación Genética Forense de Especies Silvestres, siguiendo los protocolos establecidos 7.
Extracción
El ADN de las muestras recolectadas fue aislado empleando un método de extracción casero usando sílice, adaptado de lo descrito por Hoyos y Cols. 8, los buffers de unión y elución registrados en la metodología de referencia fueron reemplazados por los buffers QG y EB de la casa comercial QIAGEN®, respectivamente. El volumen de elución final fue de 25µL.
Amplificación
Se amplificó un fragmento del 12S mitocondrial 12S-120pb a partir de 2µl de cada uno de los extractos de ADN obtenidos, en volumen total de 25µL, incluyendo master mix 1X One Taq HS® (BioLabs), BSA 0,2 mg/mL, 0,1 µM de los cebadores (Iden_12SL1t 5′CAGGAAACAGCTATGACCGGATTAGATACCCCACTATGC-3′ e Iden_12SH1t 5′TGTAAAACGACGGCCAGTATCGATTATAGAACAGGCTCC-3′) (9) y 0,5 µM de los cebadores M13REV 5′CAGGAAACAGCTATGACC-3′ y M13– 21 5′TGTAAAACGACGGCCAGT-3′ 9 , con un protocolo información disponible en la base de datos Genbank13 mediante el algoritmo BLASTn 14.
La identificación de especie se basa en que la variación entre los organismos de una especie sea menor a la variación entre los organismos de especies diferentes, lo que se conoce como “barco de gap” 15, sin embargo, cuando se presenta sobrelapamiento la asignación taxonómica se debería reportar a categoría supra específica como género o familia 16, 17, y para la emisión de los resultados se podrá hacer uso los reportes arrojados tras la comparación con la base de datos de referencia, la disponibilidad de secuencias intra e inter grupo, la presencia de polimorfismos diagnósticos, las características taxonómicas asociadas y la distribución geográfica de las especies involucradas 9.
RESULTADOS
De las seis muestras analizadas tres generaron resultados
inconcluyentes debido a la calidad deficiente de la secuencia obtenida, las
demás muestras presentaron amplificación exitosa y secuencias aptas para
análisis, como se muestra en la Figura 2, entre las cuales se pudo identificar
una especie de reptil propia de la biodiversidad colombiana. En el Cuadro 1 se
registra la asignación taxonómica
para cada muestra.
Cuadro 1. Asignación a categoría taxonómica por muestra
Fuente: Autores
Para la muestra 01: fragmento de piel, se obtuvo 100% de cobertura y 100% de identidad, con una secuencia registrada como proveniente de un organismo de la especie Boa constrictor, los porcentajes de identidad con cobertura del 100%, con secuencias de individuos de la familia Boidae y otros grupos taxonómicos, son inferiores a 90.30%, por lo tanto, la asignación taxonómica más probable es como perteneciente a la especie Boa constrictor.
Para la muestra 03: materia fecal, se obtuvo 100% de cobertura y 100% de identidad, con secuencias registradas como provenientes de organismos de la especie Mus (Mus) musculus (ratón casero común, única especie del género ampliamente distribuida a nivel global). Los porcentajes de identidad con cobertura del 100%, con secuencias de otras especies del mismo sub género (Mus) y otros grupos taxonómicos son inferiores a 99,07%, por lo tanto, la asignación taxonómica más probable para la muestra es como perteneciente a la especie Mus musculus.
Para la muestra 05: hisopado de superficie, se obtuvo 100% de cobertura y 100% de identidad, con secuencias registradas como provenientes de organismos de la especie Rattus norvegicus (rata de alcantarilla o rata noruega común) los porcentajes de identidad con cobertura del 100%, con secuencias de otras especies del mismo género y otros grupos taxonómicos son inferiores a 98,09%, sin embargo, no todas las especies del género están representadas en la base de datos y más de una especies se encuentra ampliamente distribuida a nivel global, por lo tanto, la asignación taxonómica más probable es como perteneciente al género Rattus.
DISCUSIÓN
La asignación taxonómica de evidencia producto de crímenes contra la vida silvestre, a través de técnicas de biología molecular depende de varios factores:
1. De la intervención de personal experto en el procesamiento del lugar de los hechos, lo cual es fundamental. Las muestras biológicas deben ser adecuadamente recolectadas, embaladas y conservadas, esto con el propósito de preservar el material genético presente, evitando contaminación con fuentes exógenas o productos que ocasionen
inhibición18, de tal manera que sean apropiadas para los análisis moleculares.
2. En el caso de evidencia traza o subproductos, donde la cantidad de ADN recolectado puede ser escaso o estar altamente degradado, el uso de marcadores moleculares cortos es necesario19.
3. La disponibilidad de secuencias en las bases de datos de ADN es indispensable para lograr la correcta asignación20; mientras más grande sea un grupo taxonómico la posibilidad de contar con información de todas o la mayoría de las especies es menor, y con ello, también disminuye la resolución en la asignación del espécimen.
4. Cuando se usa ADN mitocondrial para la identificación taxonómica, es importante tener en cuenta que los procesos biológicos como la heteroplasmia, la poliploidía, la introgresión, la hibridación, las copias nucleares de los genes mitocondriales (NUMT) y la clasificación incompleta del linaje pueden causar problemas de interpretación y por ende en la generación de informes 4.
En ninguna de las muestras procesadas en el presente caso, se evidenció contaminación, lo que indica una correcta recolección de evidencia; el marcador empleado con un tamaño de aproximadamente 120 pb, permitió obtener resultados en tres de las seis muestras procesadas, lo cual demuestra:
1.-Su rendimiento en muestras degradas o escasas.
2.-La eficiencia del marcador para ser empleado como tamizaje en muestras de origen desconocido.
3.-La efectividad en la asignación probable a un grupo taxonómico.
Considerando que se trata de pruebas forenses, la simple coincidencia NO debe ser empleada para realizar el reporte, es recomendable revisar la veracidad de la información respecto a la coincidencia (información publicada, coincidencia intra especie, etc.); características de grupo taxonómico tales como el número de especies que lo componen y disponibilidad de secuencias de estas, entre otros; en caso de no contar con la información suficiente o de ser contradictoria, es pertinente realizar la asignación a la categoría taxonómica jerárquica previa, de la que se tenga certeza (género, familia).
Los resultados brindaron la evidencia necesaria para demostrar la presencia de reptiles en el lugar inspeccionado y con ello la posibilidad de establecer una conducta punible, así mismo, permitieron dar a conocer la capacidad del laboratorio tanto en la toma de muestras como en el análisis molecular de muestras forenses.
En Latinoamérica son muy pocos los laboratorios forenses dedicados a la identificación de especies diferentes a la humana, a pesar de que en esta se encuentran varios de los países con la mayor biodiversidad del mundo, por lo que resulta necesario aunar esfuerzos que permitan la consolidación de información y la estandarización en los procesos contribuyendo a la investigación efectiva de los delitos contra la vida silvestre.
El caso reportado muestra la capacidad que tiene el ADN como herramienta forense para la identificación de especies silvestres de interés, facilitando la protección de la biodiversidad.
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